SUN2蛋白、其制药用途及药物的制作方法

本发明涉及生物

技术领域：

，具体涉及sun2蛋白、其制药用途及药物。

背景技术：

：巨噬细胞参与组成人体抗体外界危险信号的第一道防线，参与稳态维持，代谢调控等多个生理过程。受到微环境影响，循环系统中的单核细胞极化为巨噬细胞。巨噬细胞形态和功能多样，在天然免疫和获得性免疫中都发挥着至关重要的作用。巨噬细胞主要分为两类，即促炎的m1型以及抗炎的m2型。在gm-csf或th1细胞因子如γ干扰素以及lps的刺激下，巨噬细胞极化为m1型巨噬细胞。m1型巨噬细胞可以产生诸如il-6、il-12、il-23以及tnfα的促炎细胞因子，抑制周围细胞的增殖并损伤邻近组织。由此，m1型巨噬细胞在炎症反应和抗肿瘤免疫中发挥重要作用。相反，在m-csf或th2细胞因子如il-4以及il-13的刺激下，巨噬细胞极化为m2型巨噬细胞。m2抑制炎症反应并促进伤口修复和组织愈合。m1-m2型巨噬细胞的极化在体内受到精密调控，多种疾病和炎症与巨噬细胞极化的失调有关。巨噬细胞不仅在免疫应答和组织损伤修复中发挥作用，在肿瘤发生中也起着至关重要的作用，其中肿瘤相关巨噬细胞(tams)在炎症癌症转化过程中发挥重要作用。在肿瘤发生早期，肿瘤相关巨噬细胞具有m1型巨噬细胞的促炎症表型，而在肿瘤发生晚期，肿瘤相关巨噬细胞转化呈现出m2型巨噬细胞的表型，增强免疫抑制反应。

总体上，肿瘤相关巨噬细胞促进了肿瘤生长，在多数实体肿瘤中，如：乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌中都存在较多的肿瘤相关巨噬细胞，并与相关肿瘤的转移及预后较差有关。细胞核膜作为分隔细胞核与细胞其余部分的隔断物，在细胞生理过程中都发挥着重要作用，包括细胞骨架硬度的维持以及细胞核迁移。细胞核与细胞质通过连接细胞骨架和细胞核骨架的linc复合物传导机械力。该复合物由具有进化上保守的sun结构域及kash结构域的蛋白组成。sun蛋白是ii型膜蛋白，其结构由n端结构域，跨膜结构域以及保守的sun结构域组成。sun蛋白的n端结构域位于细胞核内，与及染色质结合蛋白相互作用。sun结构域位于细胞核双层核膜的内腔中，与kash蛋白的kash结构域结合，两者形成异源三聚体。sun-kash复合物是细胞核膜上进行机械力传导的重要组分，对细胞迁移和极化都起到重要作用。在人体中，sun蛋白以及kash蛋白的突变与包括核纤层蛋白综合征、共济失调、早老症、无脑回畸形等疾病相关。最近的研究表明sun2可能受到干扰素的调控。技术实现要素：本发明第一方面提供一种减少sun2蛋白水平或使sun2蛋白参与细胞骨架重排的活性减弱或丧失的试剂在制备治疗受益于m1型巨噬细胞增多的疾病的药物中的用途。

本发明第二方面提供一种减少sun2蛋白水平或使sun2蛋白参与细胞骨架重排的活性减弱或丧失的试剂在制备促进巨噬细胞的m1极化或去肿瘤相关巨噬细胞极化的药物中的用途。本发明第三方面提供一种减少sun2蛋白水平或使sun2蛋白参与细胞骨架重排的活性减弱或丧失的试剂在制备增强炎症反应或抗肿瘤免疫的药物中的用途。在一个或多个实施方案中，所述减少sun2蛋白水平的试剂包括：(1)提高ck2激酶表达水平的试剂；(2)提高e3泛素连接酶表达水平的试剂；和(3)抑制sun2基因表达或降低其表达水平的试剂。在一个或多个实施方案中，所述提高ck2激酶表达的试剂包括tlr2，tlr4，tlr7和tlr9的激动剂。在一个或多个实施方案中，所述提高ck2激酶表达的试剂包括malp-2、lps、r-848和。在一个或多个实施方案中，所述提高e3泛素连接酶表达水平的试剂是e3泛素连接酶的表达载体。在一个或多个实施方案中，所述e3泛素连接酶是βtrcp1或βtrcp2。在一个或多个实施方案中，所述抑制sun2基因表达或降低其表达水平的试剂是用于sun2基因的sirna。在一个或多个实施方案中，所述sirna如：6所示。

在一个或多个实施方案中，所述使sun2蛋白参与细胞骨架重排的活性减弱或丧失的试剂作用于sun2基因，使该基因所编码的sun2蛋白在其跨膜结构域和/或sun结构域中存在导致sun2蛋白参与细胞骨架重排的活性减弱或丧失的突变。在一个或多个实施方案中，所述受益于m1型巨噬细胞增多的疾病为肿瘤。在一个或多个实施方案中，所述肿瘤为与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤。在一个或多个实施方案中，所述肿瘤为实体瘤，包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、黑色素瘤和前列腺癌。本发明第四方面提供sun2基因或sun2蛋白在制备或筛选治疗受益于m1巨噬细胞增多的疾病的药物中的用途。在一个或多个实施方案中，所述sun2基因或sun2蛋白为人sun2基因或人sun2蛋白。在一个或多个实施方案中，所述sun2基因的核苷酸序列为中序列号为的序列；所述sun2蛋白序列为中序列号为.1的序列。在一个或多个实施方案中，所述药物为：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化合物、蛋白(包括抗体)或干扰慢病毒。本发明第五方面提供一种药物组合物，所述药物组合物含有减少sun2蛋白水平或使sun2蛋白参与细胞骨架重排功能减弱或丧失的试剂。

在一个或多个实施方案中，所述减少sun2蛋白水平的试剂包括：(1)提高ck2激酶表达水平的试剂；(2)提高e3泛素连接酶表达水平的试剂；和(3)抑制sun2基因表达或降低其表达水平的试剂。在一个或多个实施方案中，所述提高ck2激酶表达的试剂包括tlr2，tlr4，tlr7和tlr9的激动剂。在一个或多个实施方案中，所述提高ck2激酶表达的试剂包括malp-2、lps、r-848和。在一个或多个实施方案中，所述提高e3泛素连接酶表达水平的试剂是e3泛素连接酶的表达载体。在一个或多个实施方案中，所述e3泛素连接酶是βtrcp1或βtrcp2。在一个或多个实施方案中，所述抑制sun2基因表达或降低其表达水平的试剂是用于sun2基因的sirna。在一个或多个实施方案中，所述sirna如：6所示。在一个或多个实施方案中，所述破坏sun2蛋白参与细胞骨架重排功能的试剂作用于sun2基因，使该基因所编码的sun2蛋白在其跨膜结构域和/或sun结构域中存在导致sun2蛋白参与细胞骨架重排功能减弱或丧失的突变。本发明第六方面提供一种增强肿瘤患者的炎症反应和抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括减少该对象sun2蛋白水平或使其sun2蛋白参与细胞骨架重排功能减弱或丧失的步骤。

本发明第七方面提供一种肿瘤治疗方法，所述方法包括减少有需要的对象的sun2蛋白水平或使其sun2蛋白参与细胞骨架重排功能减弱或丧失的步骤。在一个或多个实施方案中，所述减少有需要的对象的sun2蛋白水平包括：(1)提高该对象ck2激酶表达水平；(2)提高该对象e3泛素连接酶表达水平；和/或(3)抑制该对象sun2基因表达或降低其表达水平。在一个或多个实施方案中，提高对象ck2激酶表达水平包括给予提高ck2激酶表达的试剂，包括但不限于tlr2，tlr4，tlr7和tlr9的激动剂。在一个或多个实施方案中，所述提高ck2激酶表达的试剂包括malp-2、lps、r-848和。在一个或多个实施方案中，所述提高e3泛素连接酶表达水平包括给予提高e3泛素连接酶表达水平的试剂，包括但不限于e3泛素连接酶的表达载体。在一个或多个实施方案中，所述e3泛素连接酶是βtrcp1/2。在一个或多个实施方案中，所述抑制sun2基因表达或降低其表达水平包括给予抑制sun2基因表达或降低其表达水平的试剂，包括但不限于sun2基因的sirna。在一个或多个实施方案中，所述sirna如：6所示。

在一个或多个实施方案中，所述使sun2蛋白参与细胞骨架重排功能减弱或丧失包括：给予作用于sun2基因的用于破坏sun2蛋白参与细胞骨架重排功能的试剂，使该基因所编码的sun2蛋白在其跨膜结构域和/或sun结构域中存在导致sun2蛋白参与细胞骨架重排功能减弱或丧失的突变。附图说明图1：lps刺激诱导巨噬细胞核形态变化。a：lps刺激后细胞核大小的变化；b：dapi染色观测细胞核；c：电镜检测细胞核双层核膜的间距；d：原子力显微镜观察细胞核。图2：巨噬细胞分化和极化的过程中sun1/2蛋白水平的变化。a-b：thp-1来源的巨噬细胞中蛋白表达水平；c：流式细胞分析nf4/80+pem细胞lps刺激后sun2的表达水平；d：荧光显微镜检测lps刺激后巨噬细胞中的sun2以及/c；e：thp-1来源的巨噬细胞被malp2，polyi:c，r848或cpdna刺激后，sun1/2的蛋白水平；f：巨噬细胞激活过程中sun1/2蛋白水平下调的模式图；g：pem细胞m1或m2极化后sun1/2的蛋白水平；h：骨髓来源单核细胞在gm-csf或m-csf刺激后sun1/2的蛋白水平。图3：ck2α-βtrcp介导sun1/2降解并影响细胞核微观机械力。

a：lps刺激的pem细胞以mg132处理后sun1/2的蛋白水平；b：lps刺激的pem细胞后sun2的泛素化水平；c：βtrcp1/2敲除的细胞以mg132处理后sun1/2的免疫印迹分析；d：转染βtrcp后sun2的泛素化水平；e：人、猩猩、大鼠、小鼠和鸡的sun2βtrcp的结合基序的序列对比；f：sun2与βtrcp结合的模式图；g：野生型及sa突变体的sun2的泛素化水平；h：表达突变体的thp-1来源的巨噬细胞的细胞核大小；i：原子力显微镜检测转染了野生型或sa突变体sun2的细胞核；j：lps刺激的巨噬细胞以ck2抑制剂tbb处理后sun2的免疫印迹；k：ck2α磷酸化sun2的体外激酶实验；l：thp-1来源的巨噬细胞以tbb处理后的平均细胞核大小；m：原子力显微镜检测thp-1来源的巨噬细胞以tbb处理后的细胞核。图4：sun蛋白调控细胞核微观机械力及巨噬细胞功能。a：野生型及sun1/2-/-敲除的pem细胞lps刺激后平均细胞核大小；b：野生型及sun1/2-/-敲除的mef细胞lps刺激后机械力特性；c：野生型及sun1/2-/-敲除的pem细胞的胞吞；d：野生型及sun1/2-/-敲除的pem细胞中m1型巨噬细胞标志分子；il6,il1b及nos2：及m2型巨噬细胞的标志分子(arg1,mrc1及)的转录水平；e：野生型及sun1/2-/-敲除的pem细胞的代谢水平；ecar及ocr)；f：m0,m1及m2型巨噬细胞的基准ecar及ocr水平；g：流式细胞检测巨噬细胞激活标志分子cd86(m1型)及cd206(m2型)；h：转染/2或对照sirna后f4/80+cd206+巨噬细胞的比例。

图5：敲除sun蛋白改变细胞核、细胞骨架及细胞形态。a：转染了/2或对照sirna的巨噬细胞lps刺激后f-肌动蛋白的免疫荧光；b：野生型或sun1/2-/-敲除的pem中-100可溶及不可溶组分中β-肌动蛋白的水平；c：sun蛋白介导巨噬细胞激活过程中细胞骨架变化的模式图。图6：敲除sun蛋白增强tlr细胞通路。a：野生型或sun1/2-/-敲除的pem细胞lps刺激后pikkβ,pjnk,perk及iκbαs的免疫印迹，β-肌动蛋白作为阴性对照；b：野生型或sun1/2-/-敲除的pem细胞lps刺激后细胞因子的转录水平；c：野生型或deltm突变体的sun2对il6转录水平的实验；d：野生型或sun1/2-/-敲除的pem细胞以不同tlr激动剂处理后tnfα与il-6的生成；e：细胞转染空载或myd88，irak1，traf6，ikkβ或p65以及梯度剂量的sun1/2后，荧光报告基因的活性；f：敲除sun1/2后nf-κb的激活。图7：敲除sun1/2促使巨噬细胞向m1分化。a：野生型及敲除sun1/2-/-的pem细胞胞吞实验；b：小室技术检测thp-1细胞敲除sun1/2后的迁移能力；c：细胞流式分析巨噬细胞激活标志分子，即m1巨噬细胞的标志分子cd86以及m2巨噬细胞的标志分子cd206；d：野生型及sun1/2-/-敲除的pem细胞中m1巨噬细胞中il6,il1b以及nos2的转录水平，m2巨噬细胞中arg1,mrc1以及的转录水平。

图8：敲除sun1/2增强小鼠炎症及抗肿瘤反应。a：野生型及敲除小鼠lps刺激后的生存率；b：lps刺激后小鼠肺部细胞因子的生成，elisa检测tnfα，il-1β以及il-6；c：野生型及//-/-敲除小鼠尾静脉注射b16-f10十天后的肿瘤负荷；d：野生型及//-/-敲除小鼠肺部免疫组化分析；e：野生型pymt及//-/-pymt小鼠的肿瘤大小；f：野生型pymt及//-/-pymt小鼠的肿瘤免疫组化分析。具体实施方式本申请研究了巨噬细胞分化/极化过程中细胞核形态和机械力特性的变化。结果发现，在巨噬细胞分化/极化信号的刺激下，sun2的表达水平会发生改变，动态响应细胞重构的过程并通过调控细胞骨架的重构调控巨噬细胞的功能。敲除sun蛋白可以促进m1型巨噬细胞的激活，抑制类m2型的肿瘤相关巨噬细胞的激活，从而大大增强免疫反应和抗肿瘤免疫。因此，本申请通过减少sun蛋白水平和/或sun2蛋白活性而增强炎症反应和抗肿瘤免疫，实现受益于m1型巨噬细胞增多的疾病的预防和治疗。

本申请中，sun2基因和sun2蛋白可以是来自不同来源的sun2基因和sun2蛋白，例如来自不同物种或来自同一物种的不同个体。例如，sun2基因可以是人或鼠的sun2基因。在某些实施方案中，来自人的sun2基因的核苷酸序列在中的序列号为。在某些实施方案中，本申请所述的sun2基因包括sun2的同源序列，即与中序列号为所示序列的核苷酸序列相比，在确定的分子长度内，序列显示有至少约50％，优选至少约75％，更佳至少约80％，更优选至少约85％，尤其佳至少约90％，最佳至少约95％，例如至少约98％的序列相似性的dna序列。更优选的，所述同源序列为来自小鼠的sun2基因。人sun2蛋白在中的登陆号:.1或.1。本申请中，减少sun蛋白水平包括使巨噬细胞中sun2蛋白的水平与sun2蛋白表达未受影响的野生型巨噬细胞相比降低至少30％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，甚至完全不表达sun2蛋白。可通过以下一种或多种方式减少sun蛋白水平：(1)提高ck2激酶表达水平；(2)提高e3泛素连接酶表达水平；和/或(3)抑制sun2基因表达或降低其表达水平。

可通过能提高ck2激酶表达的试剂来提高ck2激酶的表达水平。这类试剂包括但不限于tlr2，tlr4，tlr7和tlr9中的一种或任意多种。例如，这类试剂包括但不限于malp-2、lps、r-848和。在某些实施方案中，也可通过在细胞中转入激酶ck2〔如ck2α，其核苷酸序列见:.1，氨基酸序列见:.1〕的表达载体而提供其表达水平。可通过能提高e3泛素连接酶表达水平的试剂来提高e3泛素连接酶的表达水平。这类试剂包括但不限于：e3泛素连接酶的表达载体，前述能提高ck2激酶表达的试剂，以及ck2激酶的表达载体。在某些实施方案中，e3泛素连接酶是βtrcp1或βtrcp2。因此，在这些实施方案中，可通过给予βtrcp1或βtrcp2〔βtrcp1核酸序列见:.1，蛋白序列见:.1；βtrcp2核酸序列见:.1，蛋白序列见:.1〕的表达载体来提高泛素连接酶的表达水平。还可采用本领域周知的技术手段改造细胞基因组，以实现e3泛素连接酶的高水平表达。

可采用本领域周知的技术抑制sun2基因的表达或降低其表达水平。例如，可采用rnai技术干扰sun2基因的表达，或者采用同源重组技术敲除sun2基因。这些实施方案中，可通过给予相应的试剂来实现所述抑制或降低。例如，可采用sun2基因的sirna(例如，:6所示的sirna)来下调sun2基因的表达。或者，可利用打靶载体将sun2基因全基因敲除。因此，这类试剂包括但不限于sirna和打靶载体。本申请中，降低sun2蛋白的活性包括使sun2蛋白的活性与野生型sun2蛋白相比降低至少30％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，甚至完全无活性。通常，可通过在sun2蛋白中引入突变而使其活性降低。本文中，sun2蛋白的活性尤其指其参与细胞骨架重排的功能。因此，在某些实施方案中，在sun蛋白的跨膜结构域和/或sun结构域中引入致所述结构域参与细胞骨架重排功能减弱或丧失的突变；尤其优选地的是，在sun结构域中引入所述突变。突变可以是1个或数个甚至更多(例如10个以上、20个以上、30个以上)个氨基酸的插入、缺失或取代。优选的是参与细胞骨架重排所必须的氨基酸发生突变，导致所述功能减弱或丧失。

在某些实施方案中，sun2蛋白的sun结构域完全缺失。可通过给予作用于sun基因的用于破坏sun蛋白参与细胞骨架重排功能的试剂，使该基因所编码的sun蛋白在其跨膜结构域和/或sun结构域中存在导致sun蛋白参与细胞骨架重排功能减弱或丧失的突变。这类试剂可改变sun2基因的序列，导致其编码的sun2蛋白存在前文所述的突变，从而具有减弱的活性，或活性丧失。例如，可通过同源重组技术用突变的sun2基因替换野生型细胞中的sun2基因，从而导致其表达除弱活性或无活性的sun2蛋白。sun蛋白水平降低和/或sun2蛋白活性减弱或丧失有助于巨噬细胞向m1型分化、肿瘤相关巨噬细胞去极化。因此，通过减少sun蛋白水平和/或sun2蛋白活性，可增强炎症反应和抗肿瘤免疫，实现受益于m1型巨噬细胞增多的疾病的预防和治疗。受益于m1型巨噬细胞增多的疾病包括但不限于肿瘤，尤其是与肿瘤相关巨噬细胞相关的肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤为实体瘤，包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、黑色素瘤和前列腺癌。因此，本文提供前文所述的可减少sun2蛋白水平或使sun2蛋白参与细胞骨架重排的活性减弱或丧失的试剂在制备治疗受益于m1型巨噬细胞增多的疾病的药物中的用途。

基于sun2的上述功能，本发明还提供ck2激酶和/或其基因、e3泛素连接酶和/或其基因和/或sun2基因和/或sun2蛋白在制备或筛选治疗前文所述的受益于m1巨噬细胞增多的疾病的药物中的用途。这类用途包括制备或筛选能下调sun2基因表达的药物，和/或制备或筛选能抑制sun2蛋白参与细胞骨架重排活性的药物。通常，这这类应用中，ck2激酶和/或其基因、e3泛素连接酶和/或其基因和/或sun2基因和/或sun2蛋白被用作靶点。可用于治疗前文所述的受益于m1巨噬细胞增多的疾病的药物可以是核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化合物、蛋白(如抗体)或干扰慢病毒等。因此，本发明还提供一种筛选治疗前文所述的受益于m1巨噬细胞增多的疾病的药物的方法，该方法包括使待筛选药物与表达sun2蛋白的体系接触的步骤，其中，能降低该体系中sun2蛋白水平的药物为受益于m1巨噬细胞增多的疾病的候选药物。表达sun2蛋白的体系可以是各种表达sun2蛋白的细胞，包括但不限于天然表达sun2蛋白的细胞，以及经基因工程改造而表达sun2蛋白的细胞。因此，本文也提供一种药物组合物，该组合物含有本文所述的可减少sun2蛋白水平或使sun2蛋白参与细胞骨架重排的活性减弱或丧失的试剂。

所述试剂可以是核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化合物、蛋白(如抗体)或干扰慢病毒中的一种或多种。例如，所述核酸分子可以是sirna、打靶载体和等。所述小分子化合物可以是r848等。药物组合物中还可含有药学上可接受的载体或赋形剂。例如，在制备药物组合物时，通常将所述试剂与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊、纳米颗粒形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，药物组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、纳米颗粒等。药物组合物还可含有其它成分，例如湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯和甜味剂等。通常，药物组合物可含有治疗有效量的活性成分，使得药物组合物的施用量足够改变sun2基因的转录或翻译，或者足够改变sun2蛋白的表达或活性。具体剂量可考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本文中，对象通常为哺乳动物，尤其指人。下文将以具体实施例的方式阐述本发明。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如等，《分子克隆：实验室指南》(美国纽约州：冷泉港实验室出版社，1989)所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。对于试剂的用法和用量，除非另有说明，否则按照常规的用法和用量使用。基本实验方法：1、目的基因的克隆：针对所需的目的基因设计引物，用pcr的方法将该目的基因从包含此目的基因的质粒或hela细胞的cdna中克隆出来，目的基因片段两边带有两个不同的酶切位点。用琼脂糖凝胶电泳的方法检测pcr产物的大小是否与所需的目的基因大小一致，并利用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒对该片段进行回收。在胶回收产物中加入与pcr产物两边酶切位点相对应的酶以及合适的缓冲液进行双酶切，37℃孵育过夜。同时，用相同的酶双酶切该片段所要连接的载体。利用普通dna产物纯化试剂盒对酶切后的片段进行回收，利用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒对酶切后的载体进行回收，然后用t4连接酶将片段与载体连接起来，并将该连接产物转化dh5α。利用抗性筛选，验证及测序获得目的基因的克隆。2、质粒的定点突变：在突变位点附近设计一对引物，这两条引物的5’端有15-20bp的反向互补区域，突变位点应位于此反向互补区域的中间。

3’端的非互补区域的大小至少为10bp。利用这一对引物，通过pcr的方法将质粒进行反向pcr扩增。利用普通dna产物纯化试剂盒对pcr的产物进行回收，在回收产物中加入dpni，37℃孵育2h，将甲基化的质粒模板去除。然后，将dpni处理之后的样品直接转化dh5α。利用抗性筛选及测序获得目的基因的克隆。3、蛋白的表达与纯化：取原核表达质粒转化bl21，37℃培养12h。先进行接种，即挑克隆到7.5ml含有抗生素的lb培养基中，于37℃，震荡培养10-12h。然后再扩大培养，即将上述7.5ml菌液全部加入750ml含抗生素的tb培养基中，37℃，震荡培养至od600为0.6-0.8(约3-4h)。此时，将摇床温度调节至16℃，待菌液完全降温至16℃后，按照1:2000的比例加入iptg(终浓度为0.4mm)，继续震荡培养16-18h。最后用的高速冷冻离心机收集菌体，即4℃，离心10min，弃尽上清，将菌体称重后进行蛋白质纯化或保存于-80℃。gst柱亲和层析：裂解缓冲液:.0,,；洗涤缓冲液:.0,,；洗脱缓冲液:.0,,,；取适量的beads灌入层析柱中，用大量的ddh2o冲洗beads，一般为10cv×5(cv代表柱体积，下同)。

用裂解缓冲液进行平衡：10cv×5。将平衡好的beads移入菌体破碎后得到的上清中，在4℃冷库mix1-2h。500g，4℃离心2min，收集上清和流穿液。加入50ml洗涤缓冲液，500g，4℃离心2min，重复两次，。将beads灌入层析柱中，继续用洗涤缓冲液洗一次。用洗脱缓冲液洗脱：0.5cv×10，用ep管分别收集洗脱液。sds-page电泳鉴定。4、双荧光素酶报告基因实验：双荧光素酶报告基因实验是先以荧光素为底物来检测萤火虫荧光素酶的活性，后以腔肠荧光素为底物来检测海肾荧光素酶的活性，并且在后续加入海肾荧光素酶的底物同时加入了抑制萤火虫荧光素酶催化虫荧光素的物质，使后续检测仅仅测定到海肾荧光素酶的活性，实现双荧光素酶报告基因的检测。萤火虫荧光素酶可以催化虫荧光素氧化成氧合虫荧光素，在虫荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光。海肾荧光素酶可以催化腔肠荧光素氧化成，在腔肠荧光素氧化的过程中也会发出生物荧光。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪或液闪测定仪测定上述荧光素酶催化的氧化过程中释放的生物荧光。萤火虫荧光素酶催化虫荧光素发光的最强发光波长为560nm。

海肾荧光素酶催化腔肠荧光素发光的最强发光波长为465nm。通过荧光素酶和其底物这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效的检测基因的表达。通常把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶的上游或其它适当的地方，构建成报告基因质粒，然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。海肾荧光素酶更多的被用作转染效率的内参，以消除细胞数量和转染效率的差异。实验步骤：培养细胞(或其它目的细胞)，并接种于24孔板中，生长12-24小时(80％汇合度)。用转染表达萤火虫荧光素的荧光素酶报告基因质粒和海肾荧光素酶内参报告基因质粒，以及所需的目的基因表达质粒。24-48小时之后，加入细胞裂解液(5x裂解缓冲液用水稀释到1x，购自)，24孔板每孔加120μl，48孔板每孔加60μl。将该板放-80℃冻1h。将板从-80℃取出，室温融化后，将细胞裂解液吸出，转移到ep管中。每管裂解液取5μl加入到384孔板中。加入10μl萤火虫荧光素酶的反应底物，测报告基因的荧光值。加入10μl的反应底物，测海肾荧光素酶的荧光值。

报告基因与海肾荧光素荧光值的比值即为每个样品的相对荧光信号值。在检测化合物对细胞内报告基因表达影响的实验中，在细胞中转染flag标签的rig-i(残基1-238),以及ifnβ或isre的报告基因，荧光素酶报告基因。12小时后，消化细胞，以10000个细胞/每孔的密度接种至384孔板中，加入50μl的细胞培养基。7小时后，加入实验筛选获得的化合物，化合物的终浓度为10μm。37℃培养15h后，检测荧光素酶活性。5、免疫印迹：根据实验要求制备蛋白样品，100℃变性10分钟，离心2分钟，取等量的上清加到sds-page胶的上样孔中。蛋白样品在浓缩胶中时电压为80v，在分离胶中时电压为120v。电泳结束后，取下凝胶，按以下顺序安装转膜装置：(负极)、滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、滤纸、(正极)。将转膜装置放入4℃冷库，100v恒压转印1h。转膜完成后，取出硝酸纤维素膜，将膜浸泡在用tbst缓冲溶液配制的5％的脱脂牛奶中，室温下在摇床上孵育1h。用tbst缓冲溶液洗膜，5min×3次。加入按规定比例用5％bsa溶液稀释的一抗，在4℃冷库的摇床上孵育过夜。

用tbst缓冲溶液洗膜，10min×3次。加入按规定比例用5％牛奶稀释的二抗，室温下在摇床上孵育40-60min。用tbst缓冲溶液洗膜，10min×3次。将显色底物覆盖在硝酸纤维素膜上，室温显色2分钟。用冷光/生物发光影像分析仪进行拍摄。所需试剂的配制：5％bsa溶液：称取5gbsa粉末溶于×pbs溶液中，再加入0.02％的叠氮钠，贮存于4℃。10×转膜缓冲液：称取30.碱和144g甘氨酸，加入300ml甲醇，再用去离子水定容到1l。6、rna的抽提：将转染后的细胞弃去培养基，并用预冷的pbs将细胞清洗一遍。六孔板的每个孔加入500μ，室温处理5分钟。将细胞裂解液转移到1.管中。每份样品加入100μl的氯仿，低速混匀后静置5分钟。4℃，离心15分钟，转移240μl的上层水相至新的管中。每份样品加入240μl的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟。4℃，离心15分钟，弃去上清，留下白色的rna沉淀。每份样品加入500μl的75％乙醇，颠倒混匀。

4℃，离心5分钟，弃尽上清。室温晾干。加入适量depc处理过的去离子水，充分溶解。用测定所提取的rna的浓度，260nm的吸光值与280nm的吸光值的比值应维持在1.9-2.0之间。将所提取的rna用于逆转录或直接冻到-80℃保存。所需试剂的配制：磷酸缓冲盐溶液(pbs)：800ml蒸馏水溶解0.2gkcl，，0.和1.。用hcl调节溶液的ph值至7.4，定容至1l。高压蒸汽灭菌或过滤除菌。7、免疫共沉淀：将转染后的细胞弃去培养基，并用预冷的pbs将细胞清洗一遍。加入适量的细胞裂解缓冲液ripa(含蛋白酶抑制剂)，冰上裂解30min，将细胞裂解液于4℃，最大转速离心30min后取上清。取所需量的蛋白a/g琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次。取少量裂解液以备分析，剩余裂解液中加入20μl预处理过的蛋白a/g琼脂糖珠和1μg相应的抗体，在4℃冷库的上缓慢旋转孵育过夜。免疫沉淀反应完成后，在4℃以的速度离心1min，将琼脂糖珠离心至ep管底。将上清小心吸去，琼脂糖珠用300μl裂解缓冲液洗2次，再用300μlpbs洗2次。

最后加入20μl的2×sds上样缓冲液，100℃煮10分钟。利用sds-page和分析与抗体结合的蛋白所需试剂的配制：ripa缓冲液：,.0,1％-100,,。8、细胞培养：、、mef细胞培养于dmem()培养液中，培养液中添加10％血清，100ug/ml盘尼西林，100μg/ml链霉素。细胞于37℃培养，二氧化碳浓度为5％。9、显微镜观测2×105个巨噬细胞接种于带有盖玻片的6孔板中，8小时后，以1μg/ml的lps刺激。细胞经4％多聚甲醛及预冷的甲醇固定。以相应的抗体或染料对细胞进行染色，通过激光共聚焦显微镜或荧光显微镜检测细胞。10、质谱用于质谱检测的样品为细胞中免疫共沉淀获得全长sun蛋白。上述样品60ug，样品缓冲液为-.5，0.，10mm乙酸镁，通过质谱仪检测分析蛋白质潜在的相互作用蛋白和磷酸化位点。11、体外激酶活性实验反应体系为40ul，包括-ck2α，(1-154)蛋白，，缓冲液为.5,0.,10mm乙酸镁，其余体积以双蒸水补足，30℃孵育30分钟。

激酶活性实验的反应体系为40ul，包括饱和磷酸化的激酶，[γ32p]atp1.5uci，缓冲液为.5,0.,10mm乙酸镁traf6的traf结构域作为反应底物，终浓度为1mg/ml，30℃孵育20分钟。反应产物加入等体积2×sds上样缓冲液在100℃变性10分钟，sds-page分离后，通过放射自显影检测。page使用磷屏()曝光过夜，在fla-9000成像仪()上检测结果。12、mst4基因敲除小鼠的构建正常饲养的4-6周雄性c57bl/6小鼠(slac)。或对照shrna(500nm)溶解于200μl含有5％甘油和转染试剂(,,)的溶液中，shrna连续7天每天静脉注射。动物培养及动物实验遵照中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所动物管理委员会相关章程和动物福利政策，用户编号为081。13、疾病小鼠模型的建立在研究lps刺激对小鼠影响的实验中，以lps(5mg/kg)进行腹腔注射。在建立小鼠败血症模型的实验中，以5×/ml的标准腹腔注射鼠伤寒沙门氏菌菌株(,,china)，诱导细菌性腹膜炎。

为建立盲肠结扎穿刺小鼠模型，以80mg/kg的戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠，在腹部正中切口，找到盲肠，结扎回盲瓣，而后以针穿刺结扎部位两次，放回肠道，缝合腹部。记录小鼠的生存率，定期收集血清和目的器官。细菌感染后的小鼠在腹腔注射18小时后，以戊巴比妥处死，在无菌条件下收集血液，肺，脾脏，肾脏以及腹腔灌洗液。组织匀浆，血液和腹腔灌洗液以无菌pbs梯度稀释，分别接种与lb琼脂平板上，37℃培养18小时后，对每个样本的克隆进行计数。14、小鼠体内巨噬细胞过继性回输在lps刺激48小时前，通过尾静脉向小鼠注射悬浮的氯膦酸盐脂质体或pbs。48小时后采用流式细胞仪检测(,usa)，以f4/80表达为检测指标，分选巨噬细胞。腹膜巨噬细胞转染-gfp或对照gfp质粒，转染48小时以激活巨噬细胞。通过流式细胞仪分选gfp阳性细胞()，而后在lps刺激前以静脉注射的方法注入小鼠，注射时细胞密度为107。f4/80抗体购买自。15、免疫组化组织样本按照手册(手册编号:)，采用锌剂固定()并进行石蜡包埋。

组织切片(厚度5μm)通过加热固定，切片在二甲苯中脱蜡5分钟，再换用新鲜的二甲苯脱蜡，共用二甲苯脱蜡3次。无水乙醇5分钟，两次。90％乙醇5分钟，两次，70％乙醇5分钟，一次。蒸馏水5分钟，两次。根据不同的抗原和抗体，可以选择把切片放置在如下抗原修复液中，10mm柠檬酸钠，ph6.0，或，ph8.0，或,ph10.0，95℃加热12分钟，大约在30分钟内缓慢冷却至室温。加入5％脱脂牛奶封闭60分钟。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。适当比例稀释一抗，4℃缓慢摇动孵育过夜，回收一抗，加入pbst，洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。按照适当比例稀释辣根过氧化物酶(hrp)或生物素()或碱性磷酸酯酶(ap)标记的二抗。室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入pbst洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。选用dab进行后续检测。dab染色后进行he染色。最后进行.脱水，透明，中性树脂封片。16、实时定量荧光pcr：实时定量荧光pcr采用公司两步法实时pcr(-pcr)系统，检测相对ct值。

使用定量荧光pcr预混液(公司提供ent)配置反应体系检测并定量目标基因的表达水平，gapdh作为内参。17、数据分析：采用sas数据软件分析包(9.1.3)对数据进行分析，统计数据的平均数±标准差。单因子变异数分析(anova)以及’st-test用于分析连续变量。置信区间为p中国科学院上海生命科学研究院sun2蛋白、其制药用途及药物.人工序列()(1)..(58)βtrcp1/2的人工序列()(1)..(58)βtrcp1/2的人工序列()(1)..(32)引物a人工序列()(1)..(32)引物a/rna人工序列()(1)..(21)/rna人工序列()(1)..(21)/rna人工序列()(1)..(21)/rna人工序列()(1)..(21)/rna人工序列()(1)..(21)人工序列()(1)..(21)引物人工序列()(1)..(21)引物人工序列()(1)..(22)引物人工序列()(1)..(21)引物人工序列()(1)..(23)引物人工序列()(1)..(19)引物人工序列()(1)..(19)引物人工序列()(1)..(22)引物人工序列()(1)..(22)引物人工序列()(1)..(21)引物人工序列()(1)..(23)引物人工序列()(1)..(23)引物人工序列()(1)..(22)引物人工序列()(1)..(22)引物人工序列()(1)..(20)引物人工序列()(1)..(20)引物人工序列()(1)..(21)引物人工序列()(1)..(23)引物人工序列()(1)..(21)引物人工序列()(1)..(20)引物人工序列()(1)..(19)引物人工序列()(1)..(22)引物人工序列()(1)..(41)引物人工序列()(1)..(37)引物7当前第1页12

技术特征：

技术总结

本发明涉及SUN2蛋白、其制药用途及药物。具体而言，本发明涉及减少SUN2蛋白水平或使SUN2蛋白参与细胞骨架重排的活性减弱或丧失的试剂在制备治疗受益于M1型巨噬细胞增多的疾病的药物中的用途，或在制备促进巨噬细胞的M1极化或去肿瘤相关巨噬细胞极化的药物中的用途，或在制备增强炎症反应或抗肿瘤免疫的药物中的用途。本申请通过减少SUN蛋白水平和/或SUN2蛋白活性而增强免疫反应和抗肿瘤免疫，实现受益于M1型巨噬细胞增多的疾病的预防和治疗。

技术研发人员：周兆才;焦石

受保护的技术使用者：中国科学院上海生命科学研究院

技术研发日：2017.10.12

技术公布日：2019.04.19